微生物鉴定——酵母菌的培养及鉴定流程

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酵母菌作为一类重要的真菌，被广泛应用于人类的生产活动中。今天，小编给大家梳理的知识主要是酵母菌从分离筛选、纯化培养到鉴定的全套流程，希望可以帮助大家更好地理解酵母菌的鉴定。

分离、纯化培养

1、样品处理

以种子样品为例，首先需要对种子样品进行表面灭菌处理，并使用无菌研钵进行粉碎，然后将粉末加入到一定量的无菌水中形成原液，此后再进行稀释（一般稀释到10^-6即可）。

2、酵母菌的分离

无菌条件下，取样品稀释液100-150微升至培养基中，使用无菌涂布器将其接种于培养基中（酵母菌常用培养基包括MEA培养基、PDA培养基、YPD培养基等），每个梯度2-3个平行，28℃培养48-72小时。

3、纯化培养

在平行平板中选取菌株分布均匀、数量适宜的平板，挑取其中的单菌落将其以平板划线方式接种于新的MEA培养基中，28℃培养48-72小时。然后挑取单菌落接种至新鲜的MEA斜面上与4℃进行保藏。

属、种水平的鉴定

1、DNA提取

通过冻融法或者试剂盒对酵母的DNA进行提取。1）冻融法提取步骤如下：从平板上挑取细菌溶于30 μL无菌水中，先用沸水浴中煮3 min，再放入−20℃冰箱中3 min，重复3次，离心，上清液中即含有细菌DNA。2）试剂盒提取只需要按照试剂盒说明书进行提取即可。

2、26S rRNA基因的PCR扩增与序列测定

与细菌不同的是，酵母菌的鉴定一般通过26S rRNA（600 bp左右）就可以一步将其鉴定到种水平。26S rRNA基因序列扩增引物：正向 NL⁃1：（5’⁃ GCATATCAATAAGCGGAAAAG ⁃3’ ）和反向引 物 NL⁃4：（5’⁃ GGTCCGTGTTTCAAGACGG ⁃ 3’ ）。26S rRNA基因扩增条件均为 94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，52 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，30个循环 ；72 ℃ 8 min。扩增体系为：基因组模板 DNA 1 μL、2×Easy TaqTM PCR Super Mix 25 μL、引物 NL⁃1与引物 NL⁃4各 1 μL、ddH2O 20 μL。扩增完成后，取一定量PCR 产物通过 1. 0%琼脂糖凝胶电泳来确认 PCR产物质量。最后将扩增产物送到测序公司进行测序。

3、BLAST

将测序得到的26S rRNA基因序列（FASTA格式）上传至GenBank/EMBL/DDBJ数据库进行BLAST，流程如下：打开NCBI官网（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），点击右侧的BLAST，选择Nucleotide BLAST，进入比对页面，在blastn选项下面粘贴入比对的序列（粘贴的序列中间不能有空格），其他选项见下图。然后点击BLAST进行序列比对（需要一定时间，页面隔几秒刷新一次）。比对结果中一般序列同源性大于99%就可以将其归为一类。然后根据比对结果筛选并下载10-12条比对序列构建系统发育树（筛选原则与细菌鉴定类似，具体参见之前文章）。

4、系统发育树构建

与细菌构建系统发育树流程一致，具体参见此前文章（菌种鉴定——如何构建系统发育树）。

5、Genbank号的获取

与细菌GneBank号获取流程相似，具体参见此前文章，提交过程中修改对应选项即可（还不知道如何将16S rRNA序列提交至NCBI获取Genbank号？我教你吖）。

株水平的确定

主要通过分子分型技术（RAPD）确立同类酵母菌是不是同一株，具体流程如下：以此前提取的酵母DNA为模板，使用引物（如：OPA⁃02（5’⁃TGCCGAGCTG⁃3’ ）、OPA ⁃18（5’⁃AGGTGACCGT⁃3’ ）、OPL⁃07 （5’⁃AGGCGGGAAC⁃3’）、OPL⁃16（5’⁃AGGTTGCAGG⁃3’ ）、OPM⁃05（5’⁃GGGAACGTGT-3’)等）对其进行PCR随机多态性扩增，扩增条件一般为95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min， 72 ℃ 2 min，45个循环 ；72 ℃ 10 min。扩增体系为：基因组模板 DNA 1. 5 μL、2×Easy TaqTM PCR Super Mix 10 μL、引物 1. 5 μL、ddH2O 7 μL。扩增完成 后 ，取 10 μL PCR产物点样 1. 0%琼脂糖凝胶进行电泳分析（根据电泳条带分析同类酵母菌是否属于同一株型）。